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豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR檢測試劑盒

發布時間:2014-01-23 13:59:21

用途

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測試劑盒,用于檢測疑似感染動物的血清或組織中的PRRSV,適用于PRRSV的檢測、診斷和流行病學調查。

原理

利用離心柱內硅基質膜提取RNA,在反轉錄酶的作用下,以 RNA為模板,引物為起點合成與RNA模板互補的cDNA鏈。在 TaqDNA聚合酶的作用下,經高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環,使特異 DNA片段的拷貝數放大一倍。經過 35次循環,最終使擴增 DNA片段放大了數百萬倍。將擴增 DNA片段進行電泳,經染色后,在紫外燈照射下,肉眼可見到 DNA片段的擴增帶。

試劑盒組成

名稱

組分

10頭份

20頭份

貯藏條件

A

(核酸提取)

吸附柱(Spin Column

10(支)

20(支)

室溫

12個月

2ml收集管(Collection Tube

20(支)

40(支)

試劑Ⅰ(Reagent Ⅰ)

2.4ml

4.4ml

試劑Ⅱ(Reagent Ⅱ)

800μl

1.6ml

異丙醇(Isopropanol 

5mL

8ml

洗液Ⅰ* Rinse Ⅰ)

3.5ml

7ml

洗液Ⅱ* Rinse Ⅱ)

3ml

6ml

洗脫液(Elution Buffer

600μl

1.1ml

B

RT-PCR檢測)

陽性對照(Positive Control

600μl

1ml

-20

6個月

陰性對照(Negative Control

600μl

1ml

RT-PCR反應液(RT-PCR reaction solution

231μl

462μl

酶混合液(Mixture enzyme

11μl

22μl

*洗液Ⅰ首次使用前,請添加2.5ml10頭份)/5ml20頭份)100%乙醇。

*洗液Ⅱ首次使用前,請添加7ml10頭份)/14ml20頭份)100%乙醇。

需要自備的器材及試劑

器材:PCR擴增儀、電泳系統、紫外凝膠成像儀、可調移液器(2.5μl10μl200μl1000μl)、離心機、微波爐、一次性RNase Free吸頭(10μl200μl1000μl)、RNase Free 1.5ml離心管、0.2mlPCR管。

試劑:瓊脂糖、Marker、核酸染色液、TAE電泳緩沖液、PBS液(0.01M,pH7.2-7.4)。

使用注意事項

所有接觸病料的物品均應合理處理,以免造成人員傷害及污染實驗室。

所有試劑應在規定的溫度儲藏,-20℃保存的各試劑使用前應放于室溫完全融化,使用后立即放回-20℃。

嚴格遵守操作說明可以獲得良好的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。

反復凍融試劑將減低檢測靈敏度,建議在3次內用完,請嚴格按照試劑盒說明書操作。

樣品制備

       1樣品采集:病死或撲殺的豬、死亡胎兒等,取肺、扁桃體、脾臟和淋巴結等組織;待檢活豬,用注射器取血5ml28℃保存,送實驗室檢測。(要求送檢病料新鮮,嚴禁反復凍融。)

2樣品處理:每份樣品分別處理。

2.1組織樣品處理:每份組織分別從三個不同位置稱取樣品約3g,用手術剪剪碎混勻后,按照1:4加入PBS液于研磨器中研磨,勻漿后48000×g離心2min,取上清液200μl1.5ml滅菌離心管(自備)中。

       2.2全血樣品處理:待血凝后取血清200μl,置1.5ml滅菌離心管(自備)中。

       2.3陽性對照處理:取陽性對照200μl,置1.5ml滅菌離心管(自備)中。

       2.4陰性對照處理:取陰性對照200μl,置1.5ml滅菌離心管(自備)中。

 

操作步驟

       1 病毒 RNA提取

       1.1 取已處理的樣品、陽性對照和陰性對照,分別加入200μl試劑Ⅰ,劇烈震蕩混勻,室溫放置3-5min

       1.2 加入75μl試劑Ⅱ,混合均勻后,4 12000×g離心3-5 min

       1.3 將上清液轉移到新的2ml收集管中,加入300μl異丙醇,上下顛倒混勻。

    1.4 將混勻液轉移至吸附柱中(提前將吸附柱安置于另一新的2ml收集管中),4 12000×g離心1 min,棄濾液。注:若吸附柱中有液體殘留,可重復離心1 min

        1.5 加入500μl洗液Ⅰ至吸附柱中, 4 12000×g離心1 min,棄濾液。

    注:請確認洗液中已經加入了指定體積的100%乙醇。

    1.6 加入800μl洗液Ⅱ至吸附柱中,4 12000×g離心1 min,棄濾液。將吸附柱放回2ml收集管中,4 12000×g離心1 min注:請確認洗液中已經加入了指定體積的100%乙醇。

    1.7 將吸附柱安置于新的1.5ml的離心管(自備)中,在吸附柱膜的中央處加入50μl洗脫液,室溫靜置3 min4 12000×g離心1 min洗脫病毒RNA注:溶解的RNA應置于-20℃或者更低溫度環境下保存。

       2 RT-PCR操作程序

   25μl體系: 使用前每份中分別加入21μl RT-PCR反應液、1μl酶混合液和3μl1.7”中

         提取的模板RNA(注:使用時可根據情況適當稀釋),混勻后按照以下程序進行PCR擴增:

50     30min

95     3min

94     50s

55     50s       35個循環

72     1min

72     10min

   3 電泳

2g瓊脂糖于250ml錐形瓶中,加入TAE電泳緩沖液200ml,于微波爐中熔解,再加入10μl核酸染色液混勻。在電泳槽內放好梳子,倒入瓊脂糖凝膠,待凝固后將PCR擴增產物10μlMarker適量點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以110-120V電壓于TAE電泳緩沖液中電泳30min,紫外燈下觀察結果。

  結果判定

陽性對照在421bp511bp處出現擴增帶、陰性對照無帶出現(引物帶除外)時,實驗結果成立。被檢樣品在421bp處出現擴增帶為豬繁殖與呼吸綜合征變異株病毒陽性,或在511bp處出現擴增帶為豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株陽性,否則為陰性。

 附:本試劑盒A盒中附贈的TAE電泳緩沖液,使用時用雙蒸水或去離子水50倍稀釋后使用。

 


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